1961-ben született Park House-ban (Norfolk, Anglia), Diana Frances Spencer néven. Anyja, Frances Burte Roche, jelenleg Frances Shand-Kydd, egy gazdag angol-ír báró lánya volt, apja, Edward John Spencer kezdetben Althorp várgrófja, később Spencer grófja. Édesapja II. Károly király (1630–1685) egyenes ági leszármazottja, de más királyi felmenőkkel is rendelkeztek. Már korán kapcsolatba került a királyi családdal, ugyanis otthonuk az uralkodó sandringhami nyári rezidenciájának szomszédságában volt. Játszótársai között tudhatta többek közt Andrew-t is, későbbi férjének öccsét.
Egészen hétéves koráig felhőtlen gyerekkora volt, jólétben nevelkedett. Ezután viszont egyre gyakoribbak lettek a családi perpatvarok, szülei – házasságtörés miatt – hamarosan el is váltak. A válás rosszul érintette Dianát, és alapjaiban járult hozzá állandó érzelmi instabilitásához. Ezt követően anyjánál volt egy rövid ideig öccsével, azonban a karácsonyi szünetben a papa nem engedte vissza hozzá a gyerekeket, és végül a bíróság is neki ítélte őket. A három gyereket sokáig dadusok nevelték, akikkel a lázadó, különc Diana sosem jött ki. Később apja újraházasodott, mostohaanyjukkal szintén rossz volt a gyerekek viszonya. Ebben az időszakban a fiatal hercegnő hol anyjánál, hol apjánál tartózkodott, sokat utazott. Tanulmányaiban sem jeleskedett, viszont kiválóan úszott és táncolt. Balett-táncos szeretett volna lenni, de 180 centiméteres magasságával ez az álma nem valósulhatott meg.
Élete legboldogabb időszakának a házasságkötése előtti londoni éveket tekintette. Szülei vettek neki ott egy lakást, ahol barátnőivel élt. Dolgozott táncoktatóként, takarítónőként, pincérnőként, végül felvették óvodai dadának.