A támadást szombaton hajnali kettőkor indította el Omar Mateen, aki egy AR–15-ös típusú félautomata fegyverhez hasonló lőfegyverrel és egy kézi lőfegyverrel elkezdte halomra lőni a Pulse melegbárban tartózkodó mintegy háromszázötven vendéget. A bárban aznap éjjel egy melegfesztivál részeként latin estet tartottak, ami miatt sokkal inkább tele volt, mint máskor. A túlélők közül többen elmondták, hogy az első lövéseket a show részének tartották. Az interneten megjelentek az áldozatok és családtagjaik közötti üzenetváltások is, amelyek szerint többen a mosdóban próbáltak menedéket találni, ahová a támadó is bezárkózott, mintegy harminc embert túszul ejtve. A rendőrök próbáltak tárgyalni vele, de miután világossá vált, hogy a férfi szándéka az, hogy mindenkit megöljön, betörték az ajtót, és lelőtték a támadót. Hajnali öt körül a rendőrség különleges egysége egy Bearcat járművel áttörte a mosdó falát, kiszabadítva a bent rekedt túlélőket. Ennek ellenére ötven halálos áldozatot követelt a támadás, és az ötvenhárom sérült közül többen még mindig válságos állapotban vannak.
Mateen a támadás előtt felhívta a rendőrségi segélyhívót, és saját magát az Iszlám Állam tábornokának nevezte.
A terrorszervezet vállalta a felelősséget a támadásért, viszont a nyomozás eddigi eredményei alapján valós kapcsolat nem állt fenn az Iszlám Állam és a floridai biztonsági őr között. A férfi köztudottan szimpatizált az Iszlám Állammal, és két alkalommal is folyt ellene FBI-vizsgálat, először 2013-ban, majd 2014-ben. A vizsgálatok során viszont az FBI képtelen volt konkrét kapcsolatot kimutatni Mateen és a szervezet között, így nem került sor vádemelésre.